柑橘是世界最重要的水果作物属之一，但许多柑橘品种对寒冷压力敏感。宜昌橙（Citrus ichangensis），一种耐寒的柑橘品种，具有识别对柑橘耐寒性至关重要的有价值代谢物的巨大潜力。然而，调节宜昌橙耐寒性的代谢变化和潜在机制在很大程度上仍然未知。2024年6月14日，华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室刘继红教授课题组在Plant Physiology上发表了题为“Transcriptome and metabolome atlas reveals contributions of sphingosine and chlorogenic acid to cold tolerance in Citrus”的研究论文，揭示了鞘氨醇和绿原酸在柑橘抗寒中的重要功能。

研究结果

1.与HB柚相比，宜昌橙具有更强的耐寒性

为了评估耐寒性，宜昌橙和HB柚子幼苗被进行了冷处理（-4℃，8小时）。八小时的冷胁迫后，与宜昌橙相比，HB柚子出现了严重的水浸和明显的叶片萎蔫（图1A）。Fv/Fm比率降低。相比之下，宜昌橙植物仅受到轻微的冷胁迫影响（图1B，E）。冷胁迫后，宜昌橙植物的电解质泄漏（EL）和丙二醛（MDA）水平显著低于HB柚子，表明宜昌橙的细胞损伤较小（图1C-D）。在冷处理后，宜昌橙中积累的ROS水平远低于HB柚子（图1F）。这些结果表明，与HB柚子相比，宜昌橙表现出了更高的耐寒性。

图1 与HB柚相比，宜昌柚具有更强的耐寒性。

2.代谢组分析

为了探索宜昌橙和HB柚子在冷胁迫下与冷相关的代谢网络的差异，对叶片进行了非靶代谢组分析。总共鉴定出512种代谢物，包括124种黄酮类化合物、69种酚酸、63种氨基酸及其衍生物、62种其他物质种萜类化合物和1种单宁（图2A）。相同时间点上，宜昌橙检测到了更剧烈的变化。宜昌橙积累了显著更高水平的黄酮类化合物、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、木脂素和香 豆素以及萜类化合物。主成分分析（PCA）显示，512种代谢物可以根据每个物种分为两组，与层次聚类分析一致（图2B）。在冷处理后12小时（上调11种，下调19种）、24小时（上调19种，下调46种）和72小时（上调32种，下调42种）分别在HB中鉴定出30、65和74种DAMs（图2C）。同样，在宜昌橙在冷处理后12小时（上调11种，下调14种）、24小时（上调10种，下调26种）和72小时（上调32种，下调25种）暴露于冷处理时鉴定出25、36和57种DAMs。通过韦恩图来展示两种物种之间不同和共有的代谢物（图2D）。结果显示，物种内共同积累的代谢物数量较多，物种间代谢物积累模式存在显著差异。综合这些数据表明，宜昌橙和HB柚子对低温的反应表现出不同的代谢物积累模式，可能与它们不同的耐寒能力有关。利用k-means聚类算法将372种差异积累的代谢物分为12个不同的聚类(图2E)。对12个聚类的分析表明，两种柑橘(2类)的冷胁迫诱导的代谢物主要由糖和醇组成，这些代谢物在植物的非生物胁迫反应中起着至关重要的作用，突出了它们作为保守的应激反应代谢物的重要性。冷处理的宜昌木瓜中有三类特定代谢物(3,4和10类)的大量积累，而在HB柚中没有观察到明显的变化。其中，脂质(鞘脂、溶磷脂酰胆碱(LPC)、溶磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC))、氨基酸及其衍生物(苯丙氨酸、酪氨酸等)、核苷酸及其衍生物(胞苷、8-羟基鸟苷等)和3种黄酮类(野柳叶素、橘皮素、紫叶黄素)在冷处理下特异性积累，部分脂质(游离脂肪酸)显著减少。8类代谢物在低温下显著增加，而在HB柚中则相反。最后，12类的大多数代谢物在两种之间存在显著差异。具体来说，这类代谢产物在HB柚中被诱导，但在宜昌木瓜中发生了微小的变化。与HB柚相比，除了典型的应激相关代谢途径(类黄酮、糖和醇合成、酚酸合成)外，宜昌橙还表现出了与脂质、氨基酸和核苷酸代谢相关的dam的特异性和显著富集。因此，假设这些代谢物的生物合成和代谢的差异赋予了宜昌橙更强的抗寒性。

图2 宜昌橙与HB柚的差异代谢组分析

3.转录组分析

对代谢相同样本进行转录组检测分析。PCA显示，前两个主成分可以清楚地区分分析的24个样本（图3A）。相关性分析显示每个处理中的三个生物学重复之间有明显的相似性，表明数据的可靠性和可重复性（图3B）。两种基因型在冷胁迫适应反应中涉及的关键代谢途径的转录重编程的差异分析显示，宜昌橙中有1102个共同DEGs，在HB柚子中有1861个共同DEGs在低温条件下。在这些DEGs中，有433个是宜昌橙特有的，而1192个是HB柚子独有的。KEGG分析显示，这些物种特异性DEGs主要参与HB柚子中的黄酮类化合物生物合成途径，而在宜昌橙中，特定基因主要富集在脂质代谢、苯丙烷生物合成和氨基酸生物合成途径中。WGCNA共鉴定出12个共表达模块（图3E），宜昌橙中优先表达的基因主要包含在红色和绿色模块中。模块-性状相关性的热图（图3F）表明，红色模块中基因的表达与宜昌橙特有的代谢物（包括Nobiletin、Tangeretin和鞘脂类，它们被归类在上述的类别4中）相关。此外，棕色模块中的基因与与海藻糖、半乳糖醇、蔗糖和Nystose相关的代谢物表现出相关性，这些也被确定为参与非生物胁迫反应的主要保守化合物。与代谢物积累动态一致，黑色和绿色模块中的基因在宜昌橙的冷处理下被诱导。总之，我们的数据揭示了代谢物产生与基因表达变化之间的强相关性，表明它们可以用来研究参与冷胁迫反应的关键代谢途径的调控。

图3 冷胁迫下宜昌木瓜(YCC)和HB柚(HB)转录组学的变化

4.鞘氨醇在增强耐寒性中起着关键作用

脂质是细胞膜的重要组成部分，在冷胁迫下的功能已得到证实。宜昌橙和HB柚子之间脂质积累差异较大，作者重点关注鞘氨醇类，包括二氢鞘氨醇和4-羟基鞘氨醇（图4A）。在鞘氨醇处理的幼苗中检测到更低的电解质泄漏（EL）和丙二醛（MDA），表明维持了更稳定的膜系统。这些发现表明鞘氨醇显著减轻了冷诱导的伤害。基于WGCNA分析，鉴定了红色模块中的三个基因（Cg7g001680、Cg2g009930和Cg7g021070），其中CiSPT，SPT（Cg7g001680）在宜昌橙中的同源基因，显示出最显著的转录丰度（图4A）。调控网络分析显示SPT与33个与应激相关的转录因子有强相关性，包括ERF、WRKY、bHLH和其他转录因子家族（基于WGCNA权重> 0.38）（图4B），表明SPT在冷响应中发挥重要作用。

为了探索SPT（Cg7g001680）在耐寒性中的作用，通过VIGS敲低了CiSPT。在冷处理下，与TRV系相比，VIGS系表现出严重的水浸和叶片萎蔫症状（图4C）。TRV-CiSPT系的叶绿素荧光和Fv/Fm比率更低，电解质泄漏和MDA含量显著更高（图4D-G）。向TRV-CiSPT外源供应5 mM鞘氨醇显著改善了VIGS系的冷敏感表型（图4C-G）。总的来说，这些结果进一步证实了CiSPT在鞘氨醇积累和增强耐寒性中发挥关键的积极作用。

图4 CiSPT基因的沉默降低了宜昌茄子的耐寒性

5.绿原酸(CGA)通过清除活性氧增强抗寒性

对物种特有的和与时间无关的差异表达基因（DEGs）进行了KEGG分析。433个DEGs与宜昌橙的压力响应途径有关，包括信号转导、MAPK信号通路、脂质代谢、植物激素信号转导和苯丙烷生物合成（图5A-B）。鉴于苯丙烷途径在植物压力响应中的关键作用，对两种物种中与代谢相关的代谢物和基因进行了全面分析。发现绿原酸（CGA）是一种以前未被识别的参与柑橘冷响应的代谢物（图5C）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）是与核心和特殊代谢都相关的关键酶，为许多下游代谢物提供前体。羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶（HCT/HQT）是催化CGA生物合成的酶。冷处理诱导编码PAL、C4H、4CL和HCT/HQT的基因在宜昌橙中的表达水平远高于HB柚子。CGA在冷胁迫下显著诱导，与HB柚子相比，宜昌橙中的含量显著更高（图S8）。HB幼苗在冷处理前先用CGA（5 mM）预处理，与未处理的植物相比，外源性CGA的应用显著提高了HB幼苗的耐寒性。在宜昌橙中通过VIGS抑制CiHCT2（与CGA积累高度相关的HCT（Cg3g004640）同源基因）表达。与TRV对照相比，TRV-CiHCT2系中的CiHCT2转录丰度显著降低（图S10）。同时，VIGS植物的CGA水平显著低于对照。暴露于冷胁迫（-4℃，8小时）后，TRV-CiHCT2植物表现出比对照更敏感的冷表型，同时电解质泄漏和MDA水平显著更高，叶绿素荧光和Fv/Fm比率更低（图6A-F）。VIGS系在叶片中的ROS积累量通过DAB和NBT的组织化学染色比TRV对照显著更多（图6G-H）。向TRV-CiHCT2植物外源施用CGA在很大程度上恢复了它们的表型和生理指标，以及显著增加的内源性CGA水平（图6F）。这些结果表明，CiHCT2的敲低扰乱了CGA的积累和ROS清除，导致耐寒性受损。

图5 绿原酸(CGA)生物合成途径的调控

图6 基因CiHCT2的沉默降低了宜昌橙的耐寒性

研究结论

本研究通过对宜昌橙和HB柚子在低温处理前后的代谢组和转录组进行分析，揭示了在冷胁迫下显著积累的共有和基因型特异性代谢物。研究发现，糖类、黄酮类和不饱和脂肪酸等物质在两种柑橘中均有积累，但宜昌橙中的含量显著高于HB柚子。此外，宜昌橙还特异性地积累了一些与脂质代谢、苯丙烷代谢和氨基酸代谢途径相关的代谢物，这些物质可能在宜昌橙的抗寒性中起到了独特的作用。同时，宜昌橙中还特异性地高积累了核苷酸及其衍生物、吲哚类和鞘脂类等信号分子类代谢物，这表明宜昌橙可能拥有更为复杂和紧密的信号网络，通过调控代谢变化来响应低温胁迫。结合代谢组和转录组的联合分析，研究揭示了脂质代谢和苯丙烷代谢途径中基因的表达量和代谢物含量与柑橘的抗寒性密切相关。深入分析显示，在低温处理下，宜昌橙中的鞘氨醇和绿原酸两种代谢物大量积累。通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，研究者沉默了宜昌橙中的CiSPT（参与鞘氨醇合成的基因）和CiHCT2（参与绿原酸合成的基因），导致这两种代谢物的内源含量显著下降，植株的抗寒能力也随之减弱。然而，当外源添加鞘氨醇和绿原酸时，可以显著恢复经过基因沉默处理的宜昌橙植株的低温敏感表型。这些结果进一步证实了CiSPT和CiHCT2在调控鞘氨醇和绿原酸积累以及增强植株抗寒性中的关键作用。