茯砖茶是一种具有丰富历史遗产的重要类型的黑茶，由于其独特的风味特征和众多的健康益处，最近引起了人们的重新关注。真菌发酵是茯砖茶生产的关键步骤，在塑造其独特品质方面起着至关重要的作用。在这个复杂的过程中，当接种真菌和各种内生菌在特定的高湿和适宜的温度条件下茁壮成长时，竞争和共生生命代谢活动发生了动态的相互作用。这种复杂的代谢干预导致茯砖茶原始成分发生深刻的生化变化，赋予茶一种精致而醇厚的香气。目前对茯砖茶的研究主要集中在优势微生物、香气以及微生物群对基本代谢物的影响上。然而，尽管有这些研究，在真菌发酵过程中，真菌与挥发性代谢物动态进化的关系、香气转化的分子基础以及真菌合成香气的具体途径的研究仍然有限。

2024年6月4日，LWT-Food Science and Technology在线发表了浙江大学题为“Dynamical changes of volatile metabolites and identification of core fungi associated with aroma formation in Fu Brick tea during the fungal fermentation”的相关研究，研究利用ITS、挥发性代谢组以及电子鼻、电子舌等技术手段，旨在揭示伏砖茶在真菌发酵过程中真菌与挥发性物质变化的相关关系。迈维代谢为本研究提供了GC-MS挥发性代谢组学的检测和分析服务。

研究结果

1.电子鼻和电子舌分析：不同发酵时间具有不同的特征

首先利用电子鼻和电子舌捕捉茯砖茶的综合香气和风味特征。根据采集的数据生成图1所示的主坐标分析(PCoA)。电子鼻结果表明，D0到D6和D9到FT（成品伏砖茶）的样本之间存在明显的分离，在不同真菌发酵时间之间无显著交集。这强调了电子鼻分析在区分茯砖茶真菌发酵不同阶段的香气特征方面的功效。电子舌的PCoA结果进一步表明样品从D0和D3分离到D6。从雷达图上可以看出，随着发酵时间的延长，酸味传感器的响应逐渐减弱，甜度传感器的响应逐渐增强。

图1.不同发酵时间电子鼻和电子舌分析

2.ITS数据分析

不同真菌发酵阶段的有效真菌序列总数如图2A所示，与FT相比，D0的数量略低。根据序列片段的相似性进一步分类，将7类茯砖茶样品中的真菌序列以97%的相似性水平进行大量过滤和聚类，得到234个OTU(图2B)。值得注意的是，在所有7类样品的整个真菌发酵过程中，12个OTUs始终存在。随着真菌发酵时间的增加，OTU数量逐渐减少。有趣的是，在FT（成品伏砖茶）阶段出现了四个额外的OTU，这种现象可能与干燥或储存过程有关。

图2.ITS数据分析

利用Chao1指数和Shannon指数进一步估算了茯砖茶真菌的α多样性。随着真菌发酵时间的增加，真菌种类丰富度显著下降。具体而言，在D3处真菌物种丰富度略有增加。FT的真菌种类丰富度高于D15。随着真菌发酵的进行，Shannon指数逐渐降低，意味着某些真菌获得竞争优势，逐渐主导生态系统。在D9 ~ D15期间，Shannon指数略有上升，这可能是由于出现了第二优势真菌。结合Chao1指数，FT记录的Shannon指数最低，说明FT虽然真菌种类增加，但有一个特殊的优势种占优势。

图3.真菌α多样性分析

为了全面评估β多样性并直观地描述样本距离关系，采用了Hcluster方法进行可视化，分析发现了茯砖茶真菌发酵过程中的两个不同阶段:第1阶段在D0，第2阶段从D3到FT。经过差异筛选，值得注意的是，所有样品的初级门均为p_子囊菌门，占有效序列的57.11% ~ 99.90%。D0阶段，p_担子菌门成为次生优势门，占有效序列的32.41%。但从D3开始，这一比例有所下降，最终达到1.52%。在属水平分析中，在D0期间鉴定出g_Wallemia、g_Penicillium和其他一些真菌，以耐盐种为主。随着真菌发酵的推进，它们的贡献逐渐减少。隶属于p_子囊菌门的Eurotium从D3到FT占据优势，占有效序列的82.00% ~ 99.05%。在D6结束时，曲霉与Eurotium的竞争停止，Eurotium在D9成为明显的胜利者(g_曲霉属真菌在D15期间略有增加，但在FT时再次下降)。关于在D9中出现亚优势菌株的猜测，物种注释表明这种情况并未发生，Eurotium仍保持绝对优势。剩余的菌株，虽然在D9中略有恢复，但在D12中逐渐减少到可以忽略不计的水平。

进一步对真菌进行了相关网络分析，以辨别它们在真菌发酵过程中的促进、拮抗和/或竞争作用。其中，g_曲霉属真菌和g_Eurotium的相对丰度最高，呈显著负相关。考虑到g_Eurotium在茯砖茶中的优势地位，它与其他9个真菌属始终保持负相关。此外，在与木质素降解、土壤微生物、木材内生菌和与树木的共生关系等不同功能相关的几个属之间观察到值得注意的正相关，这些都与真菌发酵有关。

图4.β多样性分析

3.挥发性代谢组检测和分析

挥发性物质的含量对茶叶香气的影响至关重要。利用挥发性代谢组共鉴定到包括51种酯类、50种杂环化合物、48种萜类、30种醛类、22种芳烃和其他化合物（图5B）。PCA分析表明在阶段I (D0到D6)和阶段II (D9到FT)之间观察到明显的分离（图5A），与早期的电子鼻结果一致。其中105个挥发性物质在茯砖茶真菌发酵过程中直接产生风味(rOAV>1)(图5C)。挥发性物质的数量先增加后减少，从萜类化合物转向杂环和硫化合物。值得注意的是1-p-menthene-8-thiol（KMW0466）一直主导着风味谱。

在第1阶段，风味贡献前5位分别是1-p-menthene-8-thiol（KMW0466）、β-离子酮（WMW0051*150）、5-乙  基-3-羟基-4-甲基-2 (5H)-呋喃酮（KMW0383）、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪（KMW0286）和反式-β-离子酮（KMW0583*150）。在第二阶段，前11名的贡献保持一致，KMW0466、KMW0286、WMW0051*150、KMW0383和D94(苯甲硫醇)构成了主要的5种风味物质。不同的vm具有不同的香气特征，表明从D9开始从甜美的花香和水果香味过渡到更复杂的坚果和黄瓜香味。

图5.挥发性物质检测和分析

采用严格的筛选条件(VIP>1.0,p < 0.05)对一期和二期挥发性物质进行比较分析。结果显示，22个DVMs上调(图6A)，13个DVMs下调(图6B)。值得注意的是，上调的化合物主要是醛类、酮类和萜类，而下调的化合物主要是萜类。这些转变促进了茯砖茶的转型香气从木质、蜡质和玫瑰色到更明显的绿色、黄瓜味和脂肪味(图6C)。此外，茯砖茶中的某些酮类和醛类，超过了其他黑茶中的酮类和醛类，显着影响了其独特的风味。值得注意的是，KMW0421(水杨酸甲酯)和KMW0379(2-戊基吡啶)是变化最大的DVM，是茯砖茶独特风味的关键贡献者。

图6.风味组学分析

4.ITS与挥发性代谢组联合分析

利用Spearman相关分析，构建了茯砖茶前6个真菌属与DVMs的结合网络。结果表明g_Canadida与任何上调的DVMs之间没有相关性。相反，除(E, E)-3,5- octadien -2-one（XMW0186.139 ）外，其他上调的DVMs与g_Eurotium呈正相关，与g_Aspergillus呈负相关。同样，所有下调的DVMs与g_Eurotium呈负相关，与g_Wallemia呈正相关。除1-Nonanol（KMW0344 ）外，g_Aspergillus与其他下调产物呈正相关。此外，DVMs与g_Canadida和g_Penicillium的相关性也与g_Wallemia的相关性相似。综上所述，这三个属的相对丰度呈正相关，进一步确定g_Penicillium的相对丰度与g_Aspergillus呈正相关（图7）。

图7.真菌与挥发性代谢物相关性分析

考虑到微生物活动，尤其是外源酶的分泌对黑茶中芳香物质转化的重大影响，进一步用picrust2数据库对真菌进行注释，以推断酶的功能（图8）。该预测分析确定了9种酶——腺苷-三磷酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖糖苷酶、羧酯酶、过氧化氢酶、几丁质酶、外显α-唾液酸酶和蛋白酪氨酸-磷酸酶——在整个真菌发酵过程中积极参与。考虑到D9后伏砖茶固化后的香气变化，推测香气产生的主要驱动因素与外显α-唾液酸酶活性密切相关。

图8.典型酶活性分析

为了揭示DVMs发生的潜在差异，对茯砖茶在真菌发酵过程中产生的挥发性物质进行了KEGG功能注释，共富集到5条和9条途径。在前者的路径包含在后者中。分类结果显示，真菌发酵过程中产生的挥发性物质主要通过多种途径进行合成，包括氨基酸代谢、脂质代谢、萜类和聚酮代谢、外源降解和代谢。进一步研究各阶段显著上调和下调的物质(D0、D3、D6、D9、D12、D15、FT)，确定苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、萜类骨架生物合成和α-亚麻酸代谢是关键物质形成的重要途径(图9)。值得注意的是，如上所述，真菌和挥发性物质的进化在D9后趋于稳定，D12后物质没有发生显著变化。因此，该图可以作为KEGG通路直至D12的总结。

图9.伏砖茶风味形成过程中的重要通路

研究总结

本研究对伏砖茶真菌发酵过程中获得的7组工艺样品进行了系统的比较研究。除了利用电子感觉系统对伏砖茶进行基本评估外，研究还深入研究了真菌群落演替和挥发性物质在这一复杂过程中的变化动态。ITS结果表明，g_Eurotium在D3后成为优势菌。同时，GC-MS结果揭示了真菌发酵过程中伏砖茶挥发性谱的实质性变化，近35%的挥发性物质经历了显著的变化。在rOAV>1的105个挥发性物质中，对伏砖茶的关键香气贡献因子包括1-对甲烷-8-硫醇、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪、β-紫罗兰酮和5-乙 基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮。这些化合物在整个真菌发酵过程中始终占大多数，有助于注入绿色，甜味，花香和水果香气。